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本试剂盒适用于从各种原代或传代细胞和各种实体组织，如脑、脊髓、神经结或纤维、脂肪、肝脏、消化道、肾脏、心脏、肌肉、血管、结缔组织等哺乳动物组织中提取核蛋白和胞浆蛋白。提取过程简单方便，可在1小时内完成。制备的核蛋白和胞浆蛋白不仅纯度高，保持天然活性，而且绝少交叉污染。本试剂盒含有的独特配方能够有效溶解细胞核膜组份。本试剂盒含有的蛋白酶抑制剂混合物，阻止了蛋白酶对蛋白的降解，为提取高纯度的蛋白提供了保证。本试剂盒提取的蛋白为具有天然蛋白构象的活性蛋白。

• 本试剂盒提取的蛋白可用于Western Blotting、蛋白质电泳、免疫沉淀、ELISA、转录活性分析、Gel shift凝胶阻滞实验、酶活性测定等下游蛋白研究实验。
  
• 本试剂盒中不含有EDTA，与金属螯合层析等下游应用兼容。
  
• 本试剂盒提取的蛋白样本含有高浓度的盐成分，不可直接用于2D电泳，如下游实验需要直接用于等电聚焦、双向电泳，请使用我公司其他货号的试剂盒。也可以将最后样品除盐后再用于2D电泳，用脱盐柱脱盐处理。

• 使用方便，从细胞/组织提取蛋白不需经过研磨、反复冻融、超声破碎等前处理。
  
• 将蛋白提取的时间缩短至1小时。
  
• 含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。
  
• 紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。
  
• 蛋白提取液：含多种有效成分，可以充分释放胞浆蛋白、核蛋白，又可结合释出的蛋白防止沉淀。提取液中已含磷酸酶抑制剂混合物。
  
• 蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含6种独立的蛋白酶抑制剂AEBSF、Aprotinin、Leupeptin、PepstatinA、Bestatin、E-64。每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

• 蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2～8℃保存。开盖使用后-20℃保存。
  
• 蛋白酶抑制剂在2～8℃时是固体状态，从冰箱取出后恢复室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。

• 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
  
• 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
  
• 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
  
• 蛋白酶抑制混合物避免反复冻融。
  
• 如果试剂不能短时间内用完，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
  
• 可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。

• 细胞蛋白提取
  
  • 提取液制备：
    每200μL蛋白提取液A中加入1μL蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
    每200μL蛋白提取液B中加入1μL蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
    【注】
    ● 根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
    ● 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制剂。
    ● 蛋白样品用于测定某些细胞内蛋白酶活性等下游实验时，注意据实际情况调整抑制剂混合物是否加入。
    ● 以下步骤中使用的蛋白提取液为此步配制好的含蛋白酶抑制剂的提取液。
    
  • 取5～10×10⁶个细胞，在4℃，1000×g离心5分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。
    注：
    ● 细胞数量根据实验情况调整，每次的裂解液用量并不是一定的，请根据实际情况调整。
    
  • 用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
    注：
    ● 在1000×g条件下离心5分钟。
    
  • 每20μL体积细胞沉淀（约20mg,2×106）中加入200～300μL冷的提取液A，高速涡旋振荡15秒或吹打混匀，置2～8℃条件下振荡15～30分钟。
    注：
    ● 用振荡器/摇床的较低转速，保持提取液轻微晃动即可。
    ● 没有振荡条件可以不振荡，稍微延长处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀。
    ● 如果部分细胞不能完全裂解，导致核蛋白纯度低，可以延长振荡时间。
    
  • 然后在4℃，1000×g条件下离心10分钟。
    
  • 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到胞浆蛋白，请置于冰上或-80℃冰箱保存备用。
    
  • 沉淀用PBS洗涤一次，在4℃，1000×g条件下离心5分钟，弃上清。
    
  • 在沉淀中加入200μL冷的提取液B，高速涡旋振荡5秒。
    注：
    ● 根据后面和蛋白浓度测定的情况，可调整使用量，一般在50～200μL。
    ● 加提取液B前，必须尽可能吸干提取液A，否则会影响核蛋白纯度。
    ● 也可以用PBS将沉淀洗涤一次。PBS重悬沉淀，12000×g离心5分钟。
    ● 提取液B用量根据实验细胞数量情况调整，细胞数量多则多加。也可根据预实验时最终蛋白浓度实际情况调整。
    
  • 置2～8℃条件振荡30分钟，至沉淀明显减少甚至无明显沉淀。
    注：
    ● 用振荡器/摇床的较低转速，保持提取也轻微晃动即可。
    ● 没有振荡条件可以不振荡，稍微延长处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀。
    
  • 在4℃，14000×g条件下离心10分钟。
    
  • 将上清吸人另一预冷的干净离心管，即可得到核蛋白。
    
  • 将上述蛋白提取物定量分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
    注：
    ● 建议用BCA法进行蛋白定量。
    ● 蛋白样品-80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。
• 组织蛋白提取
  
  • 提取液制备：
    每200μL蛋白提取液A中加入1μL蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
    每200μL蛋白提取液B中加入1μL蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
    注：
    ● 根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
    ● 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制剂。
    ● 蛋白样品用于测定某些细胞内蛋白酶活性等下游实验时，注意据实际情况调整抑制剂混合物是否加入。
    ● 以下步骤中使用的蛋白提取液为此步配制好的含蛋白酶抑制剂的提取液。
    
  • 取适量组织样本，用手术剪刀尽可能剪碎，加冷PBS，用组织匀浆机/匀浆器匀浆至无明显肉眼可见固体，冰上静置5分钟，小心将上清吸入另一预冷的干净离心管。
    
  • 在4℃，500×g条件下离心5分钟，弃上清。
    
  • 每20mg组织（20～30μL细胞沉淀体积）中加入200μL冷的提取液A，高速涡旋振荡15秒或吹打混匀，置2～8℃条件下振荡20～30分钟。
    注：
    ● 用振荡器/摇床的较低转速，保持提取液轻微晃动即可。
    ● 没有振荡条件可以不振荡，稍微延长处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀。
    ● 如果部分细胞不能完全裂解，导致核蛋白纯度低，可以延长振荡时间。
    
  • 然后在4℃，1000×g条件下离心10分钟。
    
  • 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到胞浆蛋白，请置于冰上或-80℃冰箱保存备用。
    
  • 沉淀用PBS洗涤一次，在4℃，1000×g条件下离心5分钟，弃上清。
    
  • 在沉淀中加入100μL～200μL冷的提取液B，高速涡旋振荡5秒。
    注：
    ● 加提取液B前，必须尽可能吸干提取液A，否则会影响核蛋白纯度。
    ● 也可以用PBS将沉淀洗涤一次。PBS重悬沉淀，12000×g离心5分钟。
    ● 提取液B用量根据实验细胞数量情况调整，细胞数量多则多加。也可根据预实验时最终蛋白浓度实际情况调整。
    
  • 置2～8℃条件振荡30～40分钟，至沉淀明显减少甚至无明显沉淀。
    注：
    ● 用振荡器/摇床的较低转速，保持提取也轻微晃动即可。
    ● 没有振荡条件可以不振荡，稍微延长处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀。
    ● 此步骤蛋白提取液处理产物中有时会出现透明胶状物，属正常现象。该透明胶状物为含有基因组DNA等的蛋白复合物。不检测和基因组DNA结合特别紧密的特定蛋白的情况下，可以直接离心取上清进行后续实验即可；如果需要检测和基因组DNA结合特别紧密的蛋白，则可以通过超声处理，300w/10秒间隔10秒，超声3分钟，随后离心取上清用于后续实验。检测一些常见的转录因子，例如NF-kappaB、p53等时，不必进行超声处理。如果引入其他外源性蛋白质不影响下游实验的话，也可以加入DNase处理。
    
  • 在4℃，12000×g条件下离心10分钟。
    
  • 将上清吸人另一预冷的干净离心管，即可得到核蛋白。
    
  • 将上述蛋白提取物定量分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
    注：
    ● 建议用BCA法进行蛋白定量。
    ● 蛋白样品-80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。

• 细胞裂解速度慢？
  为了充分保证提取得到的蛋白的活性，提取液采用独特的保护蛋白的配方，裂解能力温和，下游应用范围广。适当延长裂解时间。
  
• 蛋白浓度低？
  处理部分样本可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂A和试剂B的处理时间即可。最好在持续振荡条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。
  
• 用什么方法定量蛋白？
  建议用BCA法，不适合用Bradford法，因为试剂A中含有干扰Bradford法的组分，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。
  
• 提取时出现胶状沉淀？
  蛋白提取液B处理产物中有时会出现少量透明胶状物，属正常现象。该透明胶状物为含有基因组DNA等的复合物。不检测和基因组DNA结合特别紧密的特定蛋白的情况下，可以直接离心取上清进行后续实验即可；如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白，则可以通过超声处理，300w/10秒间隔10秒，超声3分钟，随后离心取上清用于后续实验。检测一些常见的转录因子，例如NF-kappaB、p53等时，不必进行超声处理。
  
• 提取的蛋白具有活性吗？
  本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。